A.细胞接种到多层细胞培养器中

1. 在使用前，将多层细胞培养器和细胞悬液预热至培养温度，这样会加快细胞贴壁，并显著提高细胞得率。尤其是使用10层以上细胞培养器时，预热培养器和培养基更加重要，因为大的培养器要达到指定的培养温度需要更长时间。

2.无菌操作，将细胞悬液慢慢灌注入多层细胞培养器中，建议每层加入的体积为130-200mL。亦可通过管路利用重力虹吸或使用蠕动泵将细胞悬液加入到多层细胞培养器。操作过程中尽量避免产生气泡。

3.加完细胞悬液后竖起细胞培养器并放平，保持多层细胞培养器侧立，使液面平均分配到每层。

4.逆时针旋转90，使加液口朝上，培养液便会自动平均分配到每一层中。

5.然后将多层细胞培养器平稳移至细胞培养箱中孵育培养。

B.收获细胞

1. 培养结束后将培养液倒出

2.使用无钙无镁磷酸盐缓冲液(CMF-PBS)至少清洗一遍。CMF-PBS加入量40-50mL/层，遵循细胞培养器操作步骤，确保CMF-PBS完全浸过培养面并轻轻前后晃动培养器彻底清洗掉残留的培养液，将CMF-PBS倒出，若有必要可重复清洗一次。

3.加入适量预热的细胞消化液(20-40mL/层)，遵循细胞培养器操作步骤，消化液平均分布到每层，轻轻前后左右倾斜培养器，确保消化液完全浸过培养面，轻轻拍击培养器帮助细胞从表面脱离。对于多层细胞培养器，由于不能清晰观察细胞的消化状态，建议参照完全相同培养条件下的培养瓶或1层细胞培养器的消化时间。

4.收集含有细胞的消化液，100Xg离心5分钟去除消化液并加入新鲜培养基；或者直接向多层细胞培养器中加入培养基中和消化液，轻轻晃动，将细胞全部洗脱，收集细胞悬液冷藏。

5.用CMF-PBS或培养基清洗消化过的培养器，并检查清洗液中的细胞，若有大量细胞存在清洗液中，则需要清洗多次或调整细胞消化的操作。